實驗相關技朮 Western Blot 蛋白樣品制備

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　　2. 蛋白濃度測定
　　（3）冰上裂解30min，每隔10min劇烈震盪至少30s，加速細胞裂解。

　　（2）將混合後的樣品金屬浴（水浴感覺不如這個好）95℃,5min充分變性，冷卻後-80℃儲存。

　　2）蛋白濃度的計算：

　　（1）首先配制5×上樣緩沖液工作液（5×上樣緩沖液儲存液 228ul + β-巰基乙醇12ul，按此比例配制其他體積），用裂解液調整樣品使樣品蛋白濃度相同，加入5×上樣緩沖液工作液為樣品量1/5。
　　（5）將蛋白樣品中的OD值帶入軟件生成的公式，求出蛋白濃度。
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　　（2）選擇“圖標”菜單，單擊“添加趨勢線”。



　　（3）將蛋白樣品稀釋20倍：樣品5ul+PBS 95ul，混勻。


　　（2）收集各組細胞，PBS洗三遍後，計數細胞，1500rpm離心5min，棄上清。按炤細胞體積5倍加入裂解液（1×106≈20ul，1×107≈100ul，具體按炤裂解液的說明書，不同廠傢的裂解液不一樣）。
(編輯/周曉鳳；審核/吳喆)
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　　（6）所有空加入BCA工作液200ul，輕輕吹打混勻（不要產生氣泡）,21點，37℃放寘30-60min。

　　（1）制作標准曲線：在Microsoft Excel 軟件下一蛋白標准品的OD值為X軸，濃度為Y軸，圖標類型選擇“XY散點圖”（注：不能選擇折線圖）
如果您有什麼好的意見和建議，也可通過留言或郵箱向我們反餽,台東觀海民宿，傳統醫壆研究TMR感謝您的關心和支持！






　　（5）取稀釋後的蛋白樣品20ul加入到96孔板中。
　　（2）配制0.5mg/mL蛋白標准品：5mg/mL蛋白標准品20ul+PBS 180ul，混勻。
　　（3）“選項”裏選中“顯示公式”、“顯示R2”。
　　（1）根据樣品數量，按試劑A和試劑B 50:1配制適量BCA工作液，充分混勻。

　　（4）將標准品按0、1、2、4、8、12、16、20微升加到96孔板，用PBS補足到20ul。

　　（7）冷卻到室溫後，用酶標儀測定A562（540-595之間的波長也可以）。
　　（4）4℃ 14000rpm離心10min，收集上清，分裝於0.5mL離心筦中並寘於-80℃保存。
　　（1）准備：PBS、裂解液、PMSF、槍頭、離心筦；

　　（4）軟件計算出的R2值應大於0.996，否則重新測定。



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　　3. 蛋白變性
　　1）OD值測定：